Бумажная хроматография

БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (БХ), вид хроматографии, основанный на различии в скорости перемещения компонентов анализируемой смеси по бумаге в потоке р-рителя (элюента). Хроматограммой в этом случае называют картину расположения хроматографич. зон на бумаге после завершения разделения. В БХ используется гл. обр. спец. хроматографич. бумага, к-рая должна быть максимально однородной и содержать только целлюлозные волокна. Она может служить неподвижной фазой или инертным носителем неподвижной фазы.

В распределительной БХ неподвижная фаза - адсорбированная бумагой вода или неполярные орг. р-рители, к-рыми пропитывают бумагу (вариант с обращенными фазами), а элюент - соотв. смеси орг. р-рителей с водой, часто содержащие также к-ты, комплексообразующие и др. в-ва, или водные р-ры неорг. к-т и солей. Скорость перемещения компонентов зависит от коэф. их распределения между фазами и от соотношения объемов этих фаз.

В адсорбционной БХ разделение компонентов смеси происходит благодаря различию в их сорбируемости адсорбентом - бумагой. В кач-ве элюента используются гл. обр. смеси орг. р-рителей с водой.

В ионообменной БХ используют бумагу, пропитанную ионообменными смолами. Скорость миграции компонентов в этом случае зависит гл. обр. от констант ионного обмена и рН элюента.

Осадочная БХ осуществляется на бумаге, импрегнированной р-ром реагента-осадителя, образующего с разделяемыми в-вами малорастворимые соединения. Скорость движения компонентов определяется произведениями р-римости этих соединений.

В лигандообменной БХ бумагу предварительно обрабатывают р-рами ионов металлов, напр. Сu²⁺ при разделении аминов и аминокислот. При этом компоненты перемещаются в зависимости от констант устойчивости их комплексных соед. с ионами металлов.

На практике часто реализуются одновременно неск. механизмов разделения. БХ осуществляется в стеклянных хроматографич. камерах или др. закрытых сосудах. Для улучшения воспроизводимости их часто кондиционируют, покрывая внутр. стенки фильтровальной бумагой, смоченной соответствующим р-рителем. В камеру помещают лоток с элюентом, в к-рый опускают край хроматографич. бумаги после нанесения на нее пробы разделяемых в-в (обычно объемом 1-10 мкл). Элюент движется под действием капиллярных и гравитац. сил. По расположению бумаги и направлению тока элюента различают восходящую, нисходящую и горизонтальную БХ. Хроматографирование можно проводить также в центробежном поле или в условиях градиента т-ры, что увеличивает эффективность и скорость разделения. В т. наз. двумерной БХ пробу наносят в один из углов квадратного листа и после завершения хроматографирования в одном элюенте бумагу высушивают и, повернув на 90°, погружают в др. элюент. На двумерной хроматограмме получают до n² хроматографич. зон, где и -число зон, образующихся при обычной (одномерной) БХ.

После подъема р-рителя на определенную высоту бумагу вынимают из камеры, высушивают и выявляют хроматографич. зоны. Если зоны не окрашены, хроматограмму опрыскивают р-рами специфич. реагентов, образующих с компонентами разделяемой смеси окрашенные или флуоресцирующие соединения. Используют также ферментативные и биол. методы детектирования, напр., для выявления ферментов хроматограмму обрабатывают р-ром соответствующих субстратов. Радиоактивные в-ва обнаруживают, экспонируя хроматограмму на рентгеновскую пленку.

Положения хроматографич. зон в БХ характеризуют величиной R_f, представляющей собой отношение пути, пройденного центром хроматографич. зоны, к пути, пройденному фронтом р-рителя: R_f= 1/[1 + (K_dV_s/V_m)], где К_s и V_т- объемы соотв. неподвижной и подвижной фаз, К_d-коэф. распределения в-ва между этими фазами. Погрешность определения R_f ок. 5%. В стандартизованных условиях эта величина постоянна для каждого в-ва и используется для его идентификации.

Количеств. анализ проводят непосредственно на хрома-тограммах или после отделения в-ва хроматографич. зон от целлюлозной основы. В первом случае компоненты определяют с помощью сканирующей денситометрии, флуориметрии, фотометрии или по размеру хроматографич. зон, а также активац. методами (при использовании последних двух методов зоны предварительно вырезают). Пределы обнаружения в-в в зонах по окрашенным производным составляют 0,1-10 мкг, флуориметрически -10^-3-10^-2 мкг, активационным методом - 10^-4-10^-10 мкг. Отделение компонентов от целлюлозной основы осуществляют экстрагированием, сжиганием бумаги или кипячением ее в смеси к-т. Затем компоненты определяют любым подходящим методом, обычно спектрофотометрическим, титриметрическим или кинетическим. Погрешность количеств. анализа не превышает 10%.

С помощью БХ можно разделить и анализировать практически все классы хим. соед., в т.ч. аминокислоты, сахара, стероиды. Кроме того, БХ в сочетании с двумерным электрофорезом используется как микропрепаративный метод разделения природных в-в, в частности пептидов.

Достоинства БХ: возможность разделения малых кол-в (0,001-1 мкг) в-в, высокая чувствительность, простота аппаратуры. Недостаток метода: сильное размывание хроматографич. зон, связанное с неоднородностью бумаги. Вследствие этого для разделения сложных смесей в-в необходимо использовать листы длиной ок. 1 м, что приводит к увеличению длительности эксперимента (для двумерной БХ до 15-20 ч) и большому расходу р-рителя.

Лит.: Хроматография на бумаге, пер. с чеш., М., 1962; Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам, пер. с англ., т. 1, М., 1982, с. 58-151. Б. Г. Беленький.